Née en 1949 à Paris, elle grandit dans l’Allier, avant de rejoindre Paris pour étudier à l’Institut d’études politiques de Paris. Puis, elle intègre les services préfectoraux à Besançon, où elle est chargée des affaires économiques régionales.
Marie-Guite Dufay est élue pour la première fois conseillère municipale de Besançon en 1989, avant d’adhérer quatre ans plus tard au Parti socialiste. En 2001, elle est nommée quatrième adjointe par le maire de Besançon et prend la responsabilité des politiques sociales. En 2004, elle est élue au conseil régional de Franche-Comté et en devient vice-présidente. Après le décès de Raymond Forni en janvier 2008, elle est élue présidente du conseil régional. Réélue en 2010, elle est choisie pour être tête de liste à l’élection régionale de 2015 dans la nouvelle région Bourgogne-Franche-Comté.